原代細胞培養成功以后，需要進行分離培養，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養障礙影響細胞生長。細胞由原培養瓶內分離稀釋后傳到新的培養瓶中培養的過程稱之為傳代培養。
傳代細胞允許培養的細胞擴增(形成細胞株)，可以進行細胞克隆，易于保存，但可能喪失一些特殊的細胞和分化特征。
傳代細胞形成細胞株的最大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。

操作步驟：
（1）吸掉或倒掉培養瓶內舊培養液。
（2）向瓶內加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量，以能覆蓋培養瓶底為宜。
（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，2~5min后把培養瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發現胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。
（4）吸出消化液，向瓶內加入Hanks液少量，輕輕轉動培養瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養液，終止消化。
（5）使用彎頭吸管，吸取瓶內培養液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。
（6）用計數板計數后，分別接種于新的培養瓶中，置CO2培養箱中進行培養。
（7）細胞培養換液時間應根據細胞生長的狀態和實驗要求來確定。一般2～3d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續傳代擴大培養或換成維持液。

注意事項：
（1）掌握好細胞消化的時間，消化時間過短時，細胞不宜從瓶壁脫落，過長的消化會導致細胞脫落、損傷。
（2）掌握好消化濃度，當消化液濃度過高時，消化時間應縮短，過低時細胞消化時間相對延長。