免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質印跡（Western blotting），是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。結合化學發光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。

基本步驟：
蛋白免疫印跡技術可以分為樣品制備、電泳、轉膜、免疫雜交五個步驟。
一、樣品制備
對于Western Blotting實驗而言,樣品處理是關鍵步驟之一,獲得的蛋白樣品必須均質、可溶,并解離成單個多肽亞基,且盡量減少相互間的聚集,使其最終僅依賴本身的分子量大小進行分離。 當目標蛋白的含量很低時,需要選取目標蛋白含量較高的組織或細胞器(如核抽提物),或者通過免疫沉淀等方式進行富集。通常樣品有重組蛋白、細胞和組織等。

二、電泳
將制備好的蛋白樣品加入上樣緩沖液（loading buffer），沸水煮5min。上述操作過程是為了破壞肽鏈間的二硫鍵以及蛋白分子的電荷，使蛋白質的遷移率不受蛋白質原電荷和形狀的影響，而只取決于蛋白分子量的大小。上樣針上加蛋白樣品，在電泳緩沖液中，蛋白樣品經濃縮膠凝縮后，在分離膠中按照分子量大小進行遷移，分子量小的蛋白分子遷移速率快，大分子的蛋白質則受到較大的阻力而被滯后，從而實現分子的分離效果。

三、轉膜
蛋白電泳結束后，將膠條根據待檢目標蛋白切至合適大小，等比例準備硝酸纖維素膜（NC膜）或PVDF膜（使用前需在甲醛中浸泡），轉移膜孔徑的大小根據待檢測蛋白的大小選擇，大于20kD的蛋白可用0.45mm的膜，小于20kD的蛋白用0.2mm的膜。然后裝配三明治夾心模型：海綿--三層濾紙--膠--膜--三層濾紙--海綿，放好后，排除各層之間的氣泡，固定好夾子，按固定方向將其放置在轉移槽中（保證膠中的蛋白能從膠轉移至膜上，從負極向正極移動），轉移槽置于冰浴中，防止由于電轉移時產熱造成的電阻過大，影響轉移效率。

四、封閉
在進行抗體雜交之前,需要采用異源性蛋白質先對轉印膜進行封閉,防止免疫試劑的非特異性吸附,從而降低背景,增加靈敏度,提高信噪比。常用封閉物有脫脂奶粉和 BSA(稀釋于不同的緩沖液中),但不同的抗原-抗體反應,封閉條件均不相同,沒有適合所有系統的封閉液,具體封閉條件(包括封閉液濃度、緩沖液種類、封閉時間、溫度等)需自行優化。

五、免疫雜交
轉膜結束后，將膜放至封閉液中（10%脫脂奶粉或1%FBS），室溫搖床上孵育1h。TBST漂洗3遍×10min，然后將膜放入按固定比例稀釋的待檢測蛋白抗體中（一抗），室溫孵育1h或4°C放置過夜。TBST漂洗3遍×10min，加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗，室溫搖床上孵育1h。TBST漂洗3遍×10min，加入化學發光液，避光顯色，顯色時間根據蛋白條帶出現時間確定。