1) 引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。

2) 循環的次數過多。適當增加模板的量，減少循環次數。

3) 酶的用量偏高或酶的質量不好。應降低酶量或調換另一來源的酶。

4) 退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。

5) 樣品處理不當。

6) Mg2+濃度偏高。因適當調整Mg2+使用濃度。

7) 若為PCR試劑盒。也可能時試劑盒本身質量有問題。

8) 復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。

9) 反應緩沖液未*融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化*并*混勻。

10) 引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

11) 引物量過多。減少反應體系中引物的用量。

12) 模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。

13) 外源DNA污染。確保操作的潔凈。